Thermo赛默飞7500实时荧光定量PCR系统做实验常用的染料有哪些？

关于赛默飞（Thermo Fisher）7500实时荧光定量PCR系统常用的染料，我们可以分为两大类：DNA结合染料 和水解探针。以下是详细的介绍和选择指南：

一、赛默飞7500实时荧光定量PCR仪DNA结合染料

这类染料可以嵌入任何双链DNA分子的沟槽中，一旦与DNA结合，就会发出强烈的荧光信号。其特点是“通用性强"、“成本低"、“实验设计简单"。

1、SYBR Green I

工作原理： 在PCR反应体系中免费加入SYBR Green I染料。它会特异性地嵌入新合成的双链DNA中。每扩增一条DNA分子，就结合一个染料分子，荧光信号随之增强，从而实现定量。

优点：

经济实惠： 成本远低于探针法。

使用方便： 无需设计复杂的探针，只需设计引物即可。

通用性强： 适用于任何基因的qPCR检测。

缺点：

特异性较低： 它会与任何双链DNA结合，包括引物二聚体和非特异性扩增产物，可能导致假阳性信号，影响定量的准确性。

不能进行多重PCR： 通常只能使用一个荧光通道，无法在同一反应管内检测多个靶标。

在7500上的应用： SYBR Green I的荧光信号通常被配置在FAM通道（常用的通道）进行检测。赛默飞的PowerUp SYBR Green Master Mix是其经典配套试剂。

2、TaqMan 探针

工作原理：

探针完整时，报告基团的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光。

在PCR扩增过程中，Taq酶发挥5‘ → 3’ 外切酶活性，将探针水解。

报告基团与淬灭基团分离，报告基团发出荧光。

优点：

特异性高： 需要引物和探针三者同时与模板结合才能产生信号，极大地减少了非特异性扩增带来的干扰。

可进行多重检测： 可以对不同的靶基因设计不同的探针，标记上不同颜色的报告荧光基团（如FAM, VIC, NED, ROX等），在同一反应管内同时检测多个靶标。

缺点：

成本高昂： 探针的合成费用较高。

设计复杂： 对探针的设计和优化要求较高。

在7500上的应用： 这是7500系统的强项。7500系统配备了多个荧光滤光片，可以同时检测多种染料。常用的TaqMan探针染料组合包括：

FAM - 常用，蓝色通道。

VIC / JOE / HEX - 绿色通道，常用于内参基因。

NED / TAMRA / Cy3 - 黄色通道。

ROX - 通常作为被动参照染料，用于校正孔间误差，不用于基因检测。

二、如何选择？

1、选择SYBR Green I（染料法）当：

预算有限，需要进行大量筛查实验。

检测的靶基因数量不多，且已拥有特异性很好的引物。

只是初步定性或相对定量，对定量的精准度要求不是苛刻。

需要快速建立实验方法。

2、选择TaqMan 探针（探针法）当：

对结果的特异性和准确性要求高（如病毒载量检测、基因分型、等位基因鉴别）。

需要进行多重PCR（如在同一个反应中同时检测目标基因和内参基因）。

实验背景复杂，可能存在非特异性扩增。

已有成熟的、经过验证的探针和引物序列。

无论使用哪种染料，在进行正式实验前，都必须进行方法学验证，包括引物/探针的特异性验证、扩增效率的测定以及标准曲线的建立。对于SYBR Green I法，实验结束后必须进行熔解曲线分析，以确认扩增产物是单一的特异性条带，而没有引物二聚体等非特异性产物。