ThermoFisher赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR系统正确操作方法

    QuantStudio™ 3实时荧光定量PCR系统的标准操作流程。请注意，本指南为通用操作流程，在进行任何实验前，请务必详细阅读仪器和试剂的使用说明书，并严格遵守您所在实验室的安全规范。

    一、赛默飞QuantStudio 3 qPCR系统标准操作流程

    仪器操作与运行程序

    1、启动软件：

    双击桌面上的“QuantStudio™ Design & Analysis Software"图标启动软件。

    2、创建新实验：

    点击 “New Experiment" 或 “Create New"。

    实验类型： 选择 “Quantitation (标准曲线定量)"， “Comparative Ct (ΔΔCt法)"， “Melt Curve (熔解曲线)" 等，根据您的实验目的选择。

    检测化学物质： 选择 “SYBR Green" 或 “TaqMan Probe"。

    模板选择： 可以选择空白模板或从已有实验导入板布局。

    3、设置板布局：

    在软件界面显示的虚拟96孔板上，用鼠标选中孔位。

    在右侧属性栏中，为每个孔或一组孔定义：

    Sample Name（样品名称）： 如 Sample1, Control 等。

    Task（任务）： Unknown（未知样品）, Standard（标准品）, NTC（无模板对照）等。

    Reporter（荧光染料）： 通常是FAM（SYBR Green或TaqMan探针），如果您使用多通道检测，还需选择其他染料如VIC, ROX等。

    Quencher（淬灭基团）： 软件通常会自动匹配，如MGB/NBQ。

    Quantity（浓度）： 仅对标准品（Standard）需要输入已知浓度，用于制作标准曲线。

    4、编辑运行程序：

    点击 “Assign Targets & Samples" 后，进入 “Run Method" 界面。

    点击 “Edit" 编辑热循环程序。一个典型的qPCR程序包含以下步骤：

    阶段1：预变性/UNG酶孵育（可选）

    目的：激活热启动酶，或使用UNG酶防止残留污染。

    条件：50°C for 2 min (UNG酶作用)， 95°C for 2-10 min（酶激活）。

    阶段2：PCR循环（40-45个循环）

    变性： 95°C for 5-15 seconds。

    退火/延伸： 60°C for 30-60 seconds（在此步骤采集荧光信号）。

    注意： 退火温度和时间需根据您的引物和预混液说明书进行优化。对于SYBR Green法，通常在退火/延伸结束时采集信号。

    阶段3：熔解曲线分析（SYBR Green法）

    目的：确认扩增产物的特异性。

    条件：95°C for 15 seconds -> 60°C for 1 min -> 缓慢升温至95°C（例如，每升高0.3°C采集一次荧光信号）。

    5、运行实验：

    程序设置完成后，点击 “Start Run" 或 “Run"。

    软件会提示您放置反应板。打开仪器机盖，将反应板放入样品槽，确保板子方向正确（A1孔在左上角），然后关闭机盖。

    在弹出窗口中确认板子位置，点击 “OK" 开始运行。

    软件会实时显示扩增曲线和反应进度。

    二、赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR数据分析与关机

    1、数据分析：

    运行结束后，软件会自动跳转到分析界面。

    设置基线阈值和Ct值： 软件通常会自动设置，但您可能需要手动调整基线范围（Baseline）和阈值线（Threshold），以确保所有扩增曲线的Ct值计算准确。

    查看结果： 软件会给出每个孔的Ct值。您可以根据实验类型查看结果：

    标准曲线法： 软件会生成标准曲线，并自动计算未知样品的拷贝数。

    ΔΔCt法： 软件可帮助计算相对于内参基因和对照组的基因表达相对倍数。

    熔解曲线： 查看熔解峰是否为单一尖锐峰，以确认扩增特异性。

    导出数据： 可以将结果导出为Excel或CSV格式进行进一步处理。

    2、关机：

    数据分析完成后，保存实验文件。

    退出QuantStudio软件。

    关闭电脑。

    通常情况下，QuantStudio 3主机无需关闭电源，以保持内部温度稳定并利于光学元件的保养。如果长期不用（如超过一周），可关闭主机背后电源开关。

    清理实验台面，妥善处理生物废弃物。

    三、重要注意事项与日常维护

    1、避免污染： qPCR极其敏感。配制反应液和加模板的区域应分开，勤换手套，使用带滤芯的枪头。

    2、反应体系均一性： 确保反应液混合均匀，避免产生气泡，气泡会影响荧光信号的读取。

    3、程序优化： 使用的引物应进行退火温度梯度实验和引物浓度优化。

    4、仪器维护： 定期用柔软的湿布清洁仪器表面和样品槽。如果发现信号异常，可运行仪器自带的光学校准程序（在软件工具菜单中）。

    5、ROX参比染料： 某些预混液需要添加ROX染料作为内参校正孔间误差，请根据您的预混液说明书决定是否需要在程序设置中选择“ROX"作为被动参比染料。