使用伯乐CFX Opus96实时荧光定量PCR需要注意哪些细节？

使用伯乐（Bio-Rad）CFX Opus 96 进行实时荧光定量PCR实验时，要获得准确、可重复的结果，需要注意非常多的细节。这些细节贯穿于实验准备、程序设置、运行和数据分析的整个过程。

以下是一份详细的注意事项清单，您可以将它作为标准操作程序的补充参考：

一、伯乐CFX Opus 96实时荧光定量PCR实验前准备与体系配制

这是整个实验成功的基础，“垃圾进，垃圾出" 的原则在这里体现良好。

1、RNA/DNA 模板质量：

纯度：确保模板的A260/A280比值在理想范围内（DNA: ~1.8， RNA: ~2.0），A260/A230 > 2.0，表明没有蛋白质、酚、盐类等污染。

完整性：对于RNA，务必通过琼脂糖凝胶电泳确认其完整性（清晰的28S和18S条带）。

准确定量：使用微量分光光度计（如NanoDrop）精确测定模板浓度。对于灵敏度要求高的实验，推荐使用Qubit等荧光定量法进行精确定量。

2、引物和探针：

设计与验证：使用可靠的软件设计引物，并通过常规PCR和凝胶电泳验证其特异性和扩增效率（理想效率在90%-110%之间）。

浓度优化：进行引物浓度梯度优化，找到产生低Ct值、高荧光信号且无非特异性扩增的良好浓度。通常终浓度在100-500 nM之间。

妥善保存：避免反复冻干，建议配制高浓度母液，分装后于-20℃保存。

3、试剂与体系配制：

Master Mix选择：根据实验需求选择合适的预混液（如SYBR Green或TaqMan探针法）。确认预混液是否包含ROX等被动参考染料（CFX Opus通常不需要，但需根据预混液说明书确认）。

充分解冻和混匀：将所有试剂（预混液、引物、模板）解冻并涡旋振荡混匀，短暂离心收集管壁液滴。

在冰上操作：酶和荧光染料对温度敏感，整个配制过程应在冰上进行。

精确移液：使用校准过的移液器和高质量的带滤芯吸头，避免交叉污染和取样误差。对于低浓度模板，建议增加技术重复（至少3个复孔）。

“无模板对照"和“无逆转录对照"：

NTC：必须设置！用于检测体系是否存在引物二聚体或试剂污染。

对于qRT-PCR：必须设置No-RT Control（用水代替逆转录酶），用于检测基因组DNA污染。

4、加样与封板：

避免气泡：加样时吸头应深入液面以下，缓慢打出液体，避免产生气泡。如有气泡，可在离心机中短暂离心去除。

精确封板：使用光学级封板膜。贴膜时，使用专门的封板器或刮板，确保封板膜平整、无褶皱、密封，防止运行过程中蒸发和交叉污染。

二、伯乐CFX OPUS96实时荧光定量PCR仪器设置与程序编辑

1、创建实验协议：

荧光通道选择：根据您使用的染料（如FAM for TaqMan, SYBR Green）正确选择光学检测通道。不要选错，否则检测不到信号。

三步法 vs 两步法：通常使用三步法（退火、延伸分开）有助于提高特异性，而两步法（退火和延伸合并）可以缩短运行时间。请根据引物和预混液的推荐进行选择。

温度与时间：严格按照预混液和引物说明书推荐的条件设置。常见的错误是退火温度设置不当。

熔解曲线：对于SYBR Green法，熔解曲线分析是必须的！ 程序应自动添加熔解曲线步骤（通常从65℃缓慢升温到95℃，每0.5℃采集一次信号），用于确认扩增产物的单一性和特异性。

2、板设置：

正确标注样品类型：在软件中清晰、准确地定义每个孔的样品类型（未知样品、标准品、NTC、NRT等）。这是后续数据分析的基础。

设置重复和技术重复：如果板上有生物学重复或技术重复，务必在软件中将其归为一组，以便软件自动计算平均值和标准差。

导入/导出模板：对于常规实验，可以保存板设置模板，下次直接调用，避免手动输入错误。

三、伯乐CFX OPUS96实时荧光定量PCR仪器运行与维护

1、运行前检查：

确认样品板在样品槽中放置平稳，方向正确。

确认热盖已拧紧，与反应板接触良好，以保证传热均匀和防止蒸发。

2、仪器维护：

清洁光学元件：定期（如每季度或根据使用频率）使用仪器配套的清洁工具或无水乙醇和无尘纸清洁光学元件表面，确保荧光检测的灵敏度和准确性。

软件更新：保持CFX Maestro软件的更新，以获取新的功能和错误修复。

四、伯乐CFX OPUS96实时荧光定量PCR数据分析与解读

1、基线阈值设定：

软件通常会自动设置，但需要手动检查。基线应设置在扩增曲线刚刚开始呈指数增长的平坦阶段。阈值线应设置在指数扩增期的线性范围内。所有样本的基线设置必须一致。

2、Ct值确认：

检查所有样本的扩增曲线是否平滑、呈典型的S形。异常的曲线（如起跳过早、平台期信号低、有多个峰）表明可能存在问题。

确认NTC和No-RT Control的Ct值远大于目标样本（通常Ct > 35 或 无Ct值），否则说明存在污染。

3、熔解曲线分析（SYBR Green）：

查看熔解曲线是否为单一、尖锐的峰。如果出现双峰或宽峰，表明存在引物二聚体或非特异性扩增，该样本的数据不可信。

4、标准曲线与效率（定量）：

标准品的稀释必须精确，并且要覆盖足够宽的范围（通常至少5个数量级）。

检查标准曲线的R²值（应>0.98）和扩增效率（应在90%-110%之间）。如果效率不佳，需要重新优化实验条件。

5、内参基因的选择与相对定量（ΔΔCt法）：

选择稳定的内参基因（如GAPDH, β-actin, 18S rRNA等）至关重要。在不同实验条件下，内参基因的表达量也可能发生变化，需要进行验证。

使用ΔΔCt法计算相对表达量时，确保所有计算步骤正确。

五、总结：常见问题排查清单

1、无扩增信号：检查试剂是否失活、引物是否正确、模板质量/浓度、程序设置（特别是退火温度）、荧光通道选择。

2、Ct值过大：模板降解或浓度过低、试剂失效、PCR抑制物存在、程序效率低。

3、重复性差：模板定量不准、移液误差、试剂未充分混匀、反应板密封不严或有气泡。

4、NTC有扩增：引物二聚体（优化引物浓度/退火温度）、试剂或环境被模板或扩增产物污染（更换试剂，清洁工作台）。

5、熔解曲线出现双峰：引物特异性差、有引物二聚体、退火温度过低。需要重新设计或优化引物。