伯乐CFX Opus Deepwell实时荧光定量PCR仪操作方法是什么？

伯乐（Bio-Rad）CFX Opus Deepwell实时荧光定量PCR仪的操作方法。这是一套标准、通用的操作流程，适用于大多数实验。请务必始终参考您实验室的具体SOP（标准操作程序）和试剂盒说明书，因为不同实验的细节可能有所不同。

一、CFX Opus DeepWell实时荧光定量PCR仪操作步骤详解

整个操作流程可以概括为以下四个主要阶段，CFX Maestro软件也基本按照这个逻辑引导用户：

1、创建实验方案

（1）在CFX Maestro主界面，点击 “新建实验" 或 “创建新实验"。

（2）设定实验类型： 选择“定量PCR"。

（3）编辑实验方案：

反应体积： 输入您的反应体系总体积（例如 20 µL）。

孵育温度：

预变性： 通常为95°C，持续30秒到3分钟（根据预混液说明书推荐）。

PCR循环（扩增）：

变性： 通常是95°C，持续10-15秒。

退火/延伸： 通常是60°C，持续30-60秒。在此步骤收集荧光信号。循环次数通常设为40-45个循环。

熔解曲线（可选）： 如果您的实验需要（例如使用SYBR Green染料），勾选此选项。仪器会在PCR结束后自动运行熔解曲线程序，通常从65°C缓慢升温到95°C，并持续监测荧光变化。

（4）选择荧光染料/探针：

点击“检测"或“通道"设置。

根据您使用的荧光物质，选择相应的检测通道（例如，FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5等）。ROX通常被用作参考染料，用于校正孔间误差。

为每个通道指定其检测的目标基因。

（5）保存此方案，可以为其命名以便后续调用。

2、第二步：设置板布局

（1）软件会显示一个虚拟的96孔板界面。

（2）分配样品和目标：

用鼠标选中孔或一个区域，然后在右侧面板进行设置。

样品类型： 为每个孔选择“未知"、“标准品"、“阳性对照"或“阴性对照"。

目标： 从下拉菜单中选择该孔检测的基因名称（对应之前设置的荧光通道）。

样品名称： 输入有意义的名称以便识别（例如，“Patient_1"， “Std_1e6"）。

对于标准品，您需要输入准确的初始模板浓度（例如，1,000,000 copies/µL），软件将根据这些点自动生成标准曲线。

（3）完成所有孔的设置后，板布局会以颜色和文字清晰显示。

3、第三步：运行前准备与上样

（1）准备反应体系：

在超净工作台或冰上，按照您的实验方案配制qPCR反应混合液。通常是将预混液、引物/探针、水和模板DNA/cDNA混合。

重要： 避免产生气泡，气泡会干扰光路和荧光信号。

将配制好的反应液分装到qPCR反应板的各个孔中。

（2）封板：

使用光学封板膜覆盖板面。确保封板膜平整、紧密地贴在板子上，没有褶皱和气泡。这是防止蒸发和污染的关键步骤。

（3）上样：

轻轻将反应板放入CFX Opus仪器的样品槽中。

注意方向： 确保板的A1孔位于仪器的左前方（通常有角标或图示指示）。

关闭仪器门，听到锁扣声确保关紧。

4、第四步：启动运行

回到CFX Maestro软件界面，检查所有设置无误。

点击 “开始运行" 按钮。

软件会弹出一个最终确认对话框，显示预计运行时间。确认后，点击“开始"。

仪器将开始运行您设定的温控程序，并实时采集荧光数据。您可以在软件界面上实时查看扩增曲线和荧光信号的变化。

二、CFX Opus DeepWell实时荧光定量PCR仪运行后数据分析

1、查看结果：

（1）扩增曲线图： 查看所有孔的扩增曲线是否正常（S型曲线），阴性对照有无扩增。

（2）标准曲线： 如果设置了标准品，软件会自动给出标准曲线，并显示其斜率、效率和R²值。理想的斜率在-3.3左右，效率接近100%，R² > 0.99。

（3）Ct值： 软件会为每个孔计算Ct值（阈值循环数）。

（4）熔解曲线（如果运行了）： 查看熔解峰是否单一，以确认SYBR Green实验的特异性。

2、数据导出：

您可以将Ct值、浓度结果、扩增曲线图等导出为Excel或PDF格式，用于进一步处理和报告撰写。

三、重要注意事项

1、安全重要性： 在清洁或发生泄漏时，请务必关闭仪器电源并拔掉插头。

2、防污染： 始终使用带滤芯的吸头，并在专门区域配制反应体系，以防止气溶胶污染。

3、规范操作： 操作光学封板膜和反应板时，请佩戴手套，避免用手直接接触表面，以免影响光学读数。

4、仪器维护： 定期根据手册对仪器进行清洁和维护。如果样品发生泄漏，必须立即清洁样品槽。

5、寻求帮助： 如果遇到任何仪器报警或异常结果，请首先参考用户手册，或联系伯乐的技术支持。