BioRad伯乐CFX DUET实时荧光定量PCR仪操作使用方法

伯乐CFX DUET实时荧光定量PCR仪的操作使用方法。这是一款非常经典和用户友好的qPCR仪器，其操作流程主要分为实验准备、软件设置、运行仪器和数据分析四个部分。

一、伯乐CFX DUET实时荧光定量pCR仪软件设置 - 创建并运行一个实验

在CFX Maestro软件主界面，点击 “新建实验"。

1、步骤1：设置实验类型和检测染料

（1）实验类型：选择 “定量PCR"。

（2）检测模式：

探针法：如果您使用了TaqMan探针等，选择 FAM 或其他对应荧光基团。

染料法：如果您使用了SYBR Green I等染料，选择 SYBR。

您也可以在一个实验中同时设置多种检测模式（例如，一部分孔用FAM，另一部分用HEX/VIC/JOE），这就是“DUET"名称的由来，支持双色检测。

2、步骤2：设置板布局

软件界面会显示一个虚拟的96孔板图。

（1）指定样品类型：

未知样品：您的待测样本。

阳性对照：已知含有目标序列的样品。

阴性对照：不含模板的样品（如用水代替），用于检测是否有污染。

标准品：用于制作标准曲线。您需要输入每个标准品的已知浓度。

（2）指定目标基因：为每个孔或每组孔指定检测的基因名称（例如，GeneA， ActB）。

（3）指定荧光染料：为每个孔或每组孔指定所使用的荧光通道（如FAM， SYBR）。

3、步骤3：设置反应程序

这是qPCR反应的核心步骤，通常包括三个阶段：

（1）酶激活步骤（可选，取决于预混液）：

温度：95 °C

时间：2-10 分钟

循环数：1

（2）扩增循环（PCR循环） - 重复运行40-45个循环：

变性：

温度：95 °C

时间：10-30 秒

退火/延伸：

温度：55-65 °C（根据您的引物TM值优化）

时间：30-60 秒

在此步骤末采集荧光信号。

（3）熔解曲线分析（仅适用于SYBR Green染料法）：

程序会自动添加。通常是从65°C缓慢升温到95°C，在此过程中连续采集荧光信号，用于确认扩增产物的特异性。

（4）步骤4：开始运行

检查所有设置无误后，点击右上角的 “开始运行" 按钮。

系统会弹出对话框，让您输入实验名称并选择保存位置。

确认后，仪器将开始运行程序。您可以在软件界面上实时查看反应进程、荧光信号增长曲线和温度变化。

二、伯乐CFX DUET实时荧光定量PCR仪运行后数据分析

1、查看扩增曲线：

软件会自动设置基线阈值和Ct值。您可以检查扩增曲线是否平滑，S形曲线是否典型。

2、查看熔解曲线（仅SYBR Green法）：

确认每个样品只有一个单一的尖峰。如果出现多个峰，可能意味着有引物二聚体或非特异性扩增。

3、结果分析：

相对定量（常用方法）：使用 ΔΔCt法 计算基因的相对表达量。您需要指定内参基因和对照组。

定量：如果您使用了标准品，软件会自动生成标准曲线，并根据曲线计算出每个未知样品的绝对拷贝数或浓度。

4、导出数据：您可以将结果（包括图表和数据表格）导出为PDF或Excel文件，用于报告和进一步处理。

三、重要注意事项与日常维护

1、安全重要性：在运行前确保板子或管子已密封，防止生物污染。

2、保持清洁：定期用蘸有70%乙醇的无尘纸擦拭样品槽的表面，防止灰尘或污染物影响光学系统。

3、避免强光直射：将仪器放置在稳定、无振动、远离强光源和磁场的地方。

4、软件熟悉：花些时间熟悉CFX Maestro软件的各个功能，它非常强大且直观。

5、预混液说明书：不同厂家的qPCR预混液推荐的反应程序可能略有不同，请以您所用试剂的说明书为准进行微调。

开机 → 打开CFX Maestro → 新建实验 → 设置检测染料 → 设置板布局（指定样品、基因）→ 设置反应程序（激活、变性、退火/延伸、熔解曲线）→ 保存并开始运行 → 分析数据（扩增曲线、熔解曲线、定量）→ 导出报告