biorad伯乐CFX Opus96实时荧光定量PCR仪正确操作使用方法

伯乐Bio-Rad CFX Opus 96实时荧光定量PCR仪的正确操作使用方法。这是一份详细的、分步骤的操作指南，旨在帮助您安全、准确、高效地使用该仪器。

一、伯乐CX OPUS96实时荧光定量PCR仪实验前准备

1、仪器准备

开机：打开仪器主机电源，再打开电脑。启动 CFX Maestro 软件。仪器会进行自检，确保所有指示灯正常。

预热：仪器开机后预热10-15分钟，使光学系统和加热模块稳定。

2、软件准备

在电脑上双击打开 CFX Maestro 软件。

创建新实验：点击 New Experiment 或 Create Experiment。

3、实验设计

明确您的实验目的：定量、相对定量（基因表达分析）、基因分型等。

设计好您的实验布局（板布局），包括：

待测样品：每个样品设置技术重复（通常2-3个）。

标准品（用于定量）：一系列已知浓度的DNA/cDNA，用于生成标准曲线。

阴性对照：

无模板对照：反应体系中不加任何模板，用于检测试剂或环境是否存在污染。

无逆转录对照：仅用于基因表达分析，检测基因组DNA污染。

内参基因（用于相对定量）：用于校正样品间的加样量和RNA质量差异。

4、反应体系配制（在冰上或冷却板上操作）

根据您的试剂盒说明书或自行优化的方案，计算并配制 主混合液。

推荐配制顺序：在一个1.5 mL无菌无核酸酶离心管中，按以下顺序加入：

无核酸酶水

PCR缓冲液、Mg²⁺等

dNTPs

引物 和 探针（如使用）

热启动DNA聚合酶（最后加入，避免室温下非特异性扩增）

充分混匀并短暂离心。

将主混合液分装到PCR板或八联管中。

最后在指定的模板添加区加入模板DNA/cDNA，盖上管盖/板膜。

短暂离心PCR板/八联管，确保所有液体沉于管底且无气泡。

二、伯乐CFX OPUS96实时荧光定量PCR仪上机操作流程

1、步骤1：放置样品

打开仪器的样品槽门。

如果是96孔板：将其平稳地放入样品槽中，确保板子放置平整，A1孔位于左上角。

如果是八联管：确保所有管子摆放整齐，卡在支架上，位置正确。

轻柔地关上样品槽门。

2、步骤2：在CFX Maestro软件中设置实验

（1）选择检测类型：

点击 Assay -> Select。

对于SYBR Green I染料：选择 SYBR® Green。

对于TaqMan探针：选择 FAM 或其他相应的荧光染料。

对于HRM分析：选择 HRM。

（2）设置板布局：

在虚拟的96孔板界面上，用鼠标拖动选择孔位。

为选中的孔位指定 样品名称 和 任务。

任务类型包括：

Unknown：未知样品。

Standard：标准品，并需要输入其浓度。

NTC：无模板对照。

Positive Control：阳性对照。

（3）编辑实验协议：

点击 Protocol 进入编辑界面。一个典型的qPCR程序包括三个阶段：

a. 预变性/热启动：

温度：95°C

时间：2-5分钟（根据酶的要求，激活热启动酶并确保模板变性）。

b. 扩增循环（重复40-45个循环）：

变性：95°C，10-30秒。

退火/延伸：60°C（常用），30-60秒。在此步骤采集荧光信号。

注意：如果引物Tm值较低，可能需要分开设置退火和延伸步骤。

c. 熔解曲线分析（仅适用于SYBR Green I）：

仪器会自动生成一个标准熔解曲线程序，通常为：

95°C，10秒

65°C，5秒

然后从65°C缓慢升温到95°C，每0.5°C采集一次荧光信号。

3、步骤3：启动运行

保存实验文件：为您的实验命名并保存（.pcrd 文件）。

点击 Start Run。

软件会弹出一个对话框，让您再次确认板布局和实验协议。确认无误后，点击 开始。

仪器将开始运行，您可以在软件界面上实时查看反应进程、扩增曲线和温度状态。

三、伯乐CFX OPUS96实时荧光定量PCR仪运行后数据分析

1、查看扩增曲线：

确保所有阳性样品的扩增曲线呈标准的“S"型，基线平稳，指数期明显。

检查NTC对照是否有扩增信号（应无或Ct值>35），如有则表明存在污染。

2、查看熔解曲线（SYBR Green I）：

确保每个样品只有一个单一的、尖锐的峰。出现多个峰或宽峰表明有引物二聚体或非特异性扩增。

3、进行定量分析：

定量：软件会根据标准品自动生成标准曲线（R² > 0.99，效率在90%-110%之间为佳），并计算出未知样品的起始拷贝数或浓度。

相对定量（ΔΔCt法）：

软件会先计算每个样品的内参基因（管家基因）和目标基因的Ct值。

然后通过 ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(内参基因)，ΔΔCt = ΔCt(实验组) - ΔΔCt(对照组)，最终计算出 2^(-ΔΔCt)，即基因表达的相对倍数变化。

4、导出数据：可以将图表和数据（如Ct值、浓度等）导出为Excel或PDF格式，用于报告和存档。