Thermo赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR技术参数使用说明书

QuantStudio 3 是一款紧凑、经济的96孔板qPCR仪，非常适合常规的基因表达分析、病原体检测和基因分型等应用。其特点是操作简便，软件直观。

一、赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR主要技术参数

尺寸(长宽高) 27 cm x 50 cm x 40 cm

重量 35 kg

温度范围 4-100°C

运行时间 ＜30min

通道 4个荧光通道

样本体积 10-100 μL

变温速率(模块、样本) 6.5°C/秒 3.66°C/秒

容量 1 x 96孔-0.1 ml

显示器 8英寸彩色 TFT LCD 触摸屏

激发检测范围 500-640 nm

产地 美国

关键参数解读：

1、4通道：意味着一次运行最多可以同时检测4个不同的靶基因（使用不同荧光染料标记的探针）或者进行多色熔解曲线分析。

2、LED光源与CCD检测：这种设计使其光学系统非常稳定耐用，无需像卤钨灯那样定期更换。

3、快速的升降温速率：可以显著缩短PCR循环时间，提高实验效率。

二、赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR使用说明书

1、创建新实验

在软件主界面点击 "New Experiment" (新建实验)。

2、选择实验类型：

（1）Standard Curve (Absolute Quantification)：定量，用于计算样品中模板拷贝数。

（2）Comparative ΔΔCt (Quantitation)：相对定量，用于分析基因的相对表达水平。

（3）Melt Curve：熔解曲线，用于鉴定PCR产物的特异性或进行基因分型。

（4）Genotyping：基因分型，专门用于等位基因判别。

3、设置实验板：

（1）软件会显示一个虚拟的96孔板界面。

（2）用鼠标选中孔位，在右侧面板为其分配 "Sample Type" (样品类型)，如 Unknown, Standard, NTC等。

（3）为每个孔分配 "Target" (检测目标)，例如 Gene A, Gene B, 内参基因等。你需要先创建这些目标。

（4）为每个"Target"选择对应的 "Dye" (荧光染料)，如 FAM, VIC, ROX, CY5 等。

三、程序设置

点击 "Protocol" 选项卡，设置PCR循环程序。一个典型的qPCR程序包括：

1、阶段1：UNG酶孵育 (可选，防污染)

温度：50°C

时间：2分钟

2、阶段2：预变性 (Hot Start)

温度：95°C

时间：2-10分钟 (根据酶的要求)

3、阶段3：PCR循环 (40-45个循环)

变性：95°C， 15秒

退火/延伸：60°C， 1分钟 (此步骤需根据引物Tm值优化)

在此步骤末采集荧光信号 (对于SYBR Green等染料法)。

4、阶段4：熔解曲线分析 (可选，用于SYBR Green实验)

95°C， 15秒

60°C， 1分钟

从60°C缓慢升温到95°C (例如，0.05°C/秒)，并持续采集荧光信号。

四、重要注意事项与维护

1、光学校准：建议定期（如每季度或更换实验场所后）运行光学校准程序，以确保所有荧光通道的检测准确性。

2、背景荧光校准：在创建实验时，可以选择运行"Background Calibration"（背景校准），以消除板子和试剂的本底荧光。

3、ROX参比染料：根据你所使用的qPCR预混试剂类型，在设置"Dye"时，需要正确选择是否需要ROX染料作为内参，以及其浓度级别（如 Passive Reference ROX, ROX Low, ROX High）。

4、清洁维护：定期用柔软的干布清洁仪器表面和样品槽。如果发生污染，可用70%乙醇轻微湿润的无绒布擦拭。

5、数据备份：定期备份实验数据。