thermofisher赛默飞StepOne实时荧光定量PCR仪操作使用方法

赛默飞StepOne实时荧光定量PCR仪的操作使用方法的详细指南。内容涵盖了从实验准备到数据分析的完整流程，并强调了关键注意事项。

一、赛默飞StepOne实时荧光定量PCR实验准备

1、仪器与试剂准备

仪器：确保StepOne PCR仪电源稳定，电脑已连接并安装了StepOne Software。

耗材：选择兼容的PCR反应板或八联管（如Applied Biosystems™ MicroAmp™系列）和光学盖膜。

试剂：准备好您的qPCR预混液、引物/探针、模板DNA/cDNA和无核酸酶水。

2、反应体系配制（在试剂准备区进行）

总体积：通常为20μL或10μL。

建议：配制一个主混合液，然后分装到各反应孔，最后加入模板，以减少加样误差和污染。

对照设置：

无模板对照：用水代替模板，用于检测试剂污染。

阳性对照：使用已知浓度的标准品，用于验证实验有效性。

3、上样与封膜

将配制好的反应体系小心加入到反应板或八联管中，避免产生气泡。

使用光学透明盖膜密封反应板。确保盖膜紧密贴合，无褶皱，防止蒸发和交叉污染。

二、赛默飞StepOne实时荧光定量PCR上机运行

1、启动软件与放置样品

打开电脑，启动 StepOne Software。

打开StepOne PCR仪舱门，将密封好的反应板放入仪器样品槽中，确保板子放置方向正确（A1孔在左上角）。

关闭舱门。

2、创建新实验

在软件主界面，点击 "New Experiment"（新建实验）。

3、设置实验类型

在 "Setup" 选项卡下，选择实验类型：

Quantitation (Standard Curve)：定量，需要运行标准品来制作标准曲线。

Comparative Ct (ΔΔCt)：相对定量，常用，用于分析基因的表达差异。

Melt Curve：熔解曲线，通常在SYBR Green实验后运行，用于检查扩增产物的特异性。

Allelic Discrimination：基因分型。

4、编辑样品孔布局

点击 "Plate" 选项卡。

在虚拟的反应板界面上，用鼠标选择孔位，然后右键或使用左侧工具栏定义其属性：

样品类型：未知、阳性对照、阴性对照、标准品。

样品名称：如"Sample 1"，"Control"等。

目标基因：为每个孔指定检测的基因（如GAPDH， Target Gene）。软件允许在同一块板上进行多基因检测。

重复：设置技术重复。

5、运行实验

检查所有设置无误后，点击软件右上角的 "Start Run"（开始运行）按钮。

输入实验名称和保存路径。

仪器将开始运行，您可以在软件界面上实时查看扩增曲线和温度状态。

三、日常维护

1、清洁：定期用70%乙醇和无尘纸清洁样品槽表面。

2、校准：根据仪器提示或定期进行光学校准。

3、记录：记录每次使用情况和任何异常。