赛默飞quantstudio3实时荧光定量pcr系统日常操作步骤

本指南为通用操作流程，不能替代操作手册。在进行任何实验前，请务必接受相关培训并仔细阅读仪器和试剂的使用说明书。整个操作过程需严格遵守无菌原则，防止RNA/DNA降解和PCR污染。

一、赛默飞QuantStudio3实时荧光定量PCR上机运行

1、开机与初始化

（1）打开电脑、显示器。

（2）打开QuantStudio 3主机背面的电源开关。仪器会进行自检，发出“嘀"声，样品块会移动。等待自检完成，样品块停止运动后再进行下一步。

2、创建实验

（1）双击桌面上的 “QuantStudio Design & Analysis Software" 图标，启动软件。

（2）点击软件左上角的 “New Experiment"（新建实验）。

（3）在弹出的窗口中选择实验类型：

Standard Curve (Absolute Quantification)：定量，用于计算拷贝数。

Comparative ΔΔCt (Relative Quantification)：相对定量，用于计算基因表达差异。

Melt Curve：溶解曲线，通常与SYBR Green法联用。

Genotyping：基因分型。

（4）选择完成后，点击 “Create"。

3、设置板子布局

（1）软件界面会显示一个虚拟的96孔板。

（2）在左侧的 “Well Inspector" 面板中，为每个孔或一组孔（可拖选）定义属性：

Sample Name：样本名称（如：Sample1, Control等）。

Task：任务类型（Unknown-待测样本；NTC-无模板阴性对照；Standard-标准品）。

Reporter：选择荧光染料（如：FAM, VIC等。SYBR Green通常选SYBR）。

Quencher：选择对应的淬灭基团（如：None, TAMRA等）。

Quantity：如果设置了标准品，在此处输入标准品的已知度。

4、运行实验

（1）将密封好的反应板放入仪器样品槽中，确保板子方向正确（A1孔在左上角）。

（2）在软件界面右上角，点击 “Start Run"（开始运行）。

（3）弹出窗口中确认实验名称、保存路径和反应板类型，然后点击 “OK"。

（4）仪器将开始运行程序，你可以在软件界面上实时观察扩增曲线和荧光信号的变化。

二、赛默飞QuantStudio3实时荧光定量数据分析

运行结束后，软件会自动分析数据。

1、查看扩增曲线

在“Results"页面下的“Amplification Plot"中查看所有孔的扩增曲线。理想的曲线应是“S"型，阴性对照无扩增或Ct值很大（通常>35）。

2、设置基线阈值

软件会自动设置基线和阈值（Threshold），但有时需要手动调整。确保阈值位于所有扩增曲线的指数增长期内，且与基线区分明显。

3、查看结果

点击“Plate"选项卡，可以以表格形式查看每个孔的Ct值、起始拷贝数（定量）或ΔΔCt值（相对定量）等。

对于相对定量，软件会自动计算实验组相对于对照组的基因表达变化倍数。

4、导出数据

可以通过 “File" -> “Export" 将数据导出为Excel或CSV格式，用于进一步作图或统计分析。

三、日常维护与注意事项

1、清洁：定期用柔软的湿布擦拭仪器表面。如果发生污染，用70%乙醇擦拭样品块表面。

2、关机：通常不需要关闭仪器电源，保持待机状态即可。如需长期不用，可关闭主机电源。

3、安全：在运行前后及取放板子时，注意样品块温度可能很高，防止烫伤。

4、故障排查：如果遇到异常曲线（如起跳晚、信号弱、阴性对照有扩增），请从模板质量、引物探针设计、反应体系配制、污染等方面逐一排查。