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赛默飞QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪的正确操作使用方法指南。它将分为实验准备、上机操作、运行监控和后续处理几个部分，并包含重要的注意事项。
一、赛默飞QuantStudio5实时荧光定量PCR重要部分：实验准备
1、仪器准备：
（1）开启电脑和QuantStudio 5仪器电源，等待系统启动完成。
（2）打开 QuantStudio Design and Analysis 软件。
（3）检查仪器状态，确保无错误报警。
2、实验设计：
在软件中或纸上规划好实验布局，包括：
（1）实验类型： 标准曲线定量、相对定量（ΔΔCt）、基因分型等。
（2）样品位置： 明确标准品、待测样品、阴性对照（NTC）、阳性对照（PC）在板子上的位置。
（3）探针/染料设置： 确定每个孔使用的荧光染料通道（如FAM, VIC, ROX参比染料等）。
3、反应体系配制（在试剂准备区进行）：
（1）根据试剂盒说明书或优化后的方案，计算并配制主混合液。
（2）通常包括：SYBR Green qPCR预混液（或TaqMan探针预混液）、正反向引物、探针（如果使用）、无酶水。
（3）将主混合液分装到PCR板或八连管中。
注意： 整个过程在冰上操作，避免酶失活。
二、赛默飞QuantStudio5实时荧光定量PCR第二部分：上机运行
1、放置样品板：
（1）打开QuantStudio 5的样品槽门。
（2）注意板子方向： 将板子带有A1角标（左上角）的一侧对准样品槽的对应角落，平稳放入。
（3）轻轻关上样品槽门。
2、创建并设置新实验：
（1）在软件主界面点击 "New" 或 "创建新实验"。
（2）选择实验类型： 如 Quantitation (定量) -> Standard Curve (标准曲线) 或 Quantitation - Comparative Ct (ΔΔCt)。
（3）选择板子类型： 如96-well, 0.1 mL。
3、设置实验参数：
（1）指定样品： 在软件界面的虚拟板图上，用鼠标选择孔位，然后右键或从侧边栏设置其类型（Unknown, Standard, NTC等）和样品名称。
（2）指定探针/染料： 为每个孔分配检测通道。例如，在 Detector 或 Assay 栏选择或创建对应的染料（如FAM-SYBR）。
（3）设置参比染料： 通常选择ROX作为参比染料，用于校正孔间差异。
4、编辑反应程序：
点击 Protocol 选项卡，输入以下典型的qPCR三步法程序：
（1）阶段1：UNG酶消化（可选，防污染）
50°C，2分钟
（2）阶段2：热启动/预变性
95°C，2-10分钟（根据预混液说明书）
（3）阶段3：PCR循环（40-45个循环）
变性： 95°C，15秒
退火/延伸： 60°C，1分钟 （在此步骤采集荧光信号）
（4）对于SYBR Green法，通常在退火/延伸结束时采集信号；对于TaqMan探针法，确保设置正确。
5、启动运行：
（1）检查所有参数设置无误后，点击 "Start Run"。
（2）软件会提示你输入实验名称、保存路径等信息。
（3）确认后，仪器将开始运行。你可以听到风扇启动和温控模块开始工作的声音。
三、第三部分：运行监控与数据分析
1、实时监控：
（1）在运行过程中，软件会实时显示扩增曲线、荧光信号图等。
（2）检查阴性对照（NTC）是否有扩增，阳性对照和标准品曲线是否正常。
2、运行结束：
（1）程序运行完毕后，仪器会发出提示音。
（2）软件会自动保存数据。
3、数据分析：
（1）在Analysis界面，软件会根据你选择的实验类型自动计算Ct值。
（2）对于标准曲线： 检查标准曲线的斜率和R2值（理想斜率：-3.3， R2 > 0.99）。
（3）对于熔解曲线（SYBR Green）： 检查产物特异性，单一峰表明扩增特异。
（4）设置基线（Baseline）和阈值（Threshold），确保它们设置在扩增曲线的指数增长期。
（5）导出数据结果进行进一步分析。
四、第四部分：运行后处理
1、取出样品板：
（1）待仪器温度降至安全范围后（通常为4°C或室温），打开样品槽门，取出样品板。
（2）注意： 板子和样品可能含有扩增产物，是潜在的污染源。请按照生物危害废弃物处理规定进行处理。
2、关机：
（1）通常情况下，仪器无需关闭电源，保持待机状态即可。如果长期不用，可关闭仪器和电脑电源。
（2）填写仪器使用记录。
五、常见问题排查
1、信号弱或无信号： 检查试剂是否失效、探针/引物设计是否合理、模板浓度是否过低、程序设置是否正确（特别是信号采集步骤）。
2、扩增曲线异常： 检查是否存在抑制剂、模板降解或加样错误。
3、NTC出现扩增： 表明存在污染，需检查试剂、水、耗材或操作环境。
4、ROX信号报警： 检查是否在实验中设置了ROX参比染料，但使用的预混液不含ROX，或反之。
