Thermo赛默飞7500实时荧光定量PCR系统正确操作方法

赛默飞世尔科技 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR系统的标准、安全操作流程。赛默飞世尔科技 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR系统的标准、安全操作流程。操作必须由经过培训的人员在符合生物安全规定的实验室中进行。不同版本的软件界面可能略有差异，但核心步骤一致。

赛默飞7500实时荧光定量PCR系统标准操作流程

一、开始阶段：实验前准备

1、仪器准备

（1）开机： 依次打开电脑主机、显示器，然后打开7500仪器主机电源（通常在仪器背面）。

（2）启动软件： 双击桌面上的 “7500 System Software" 图标启动软件。软件将自动进行自检和初始化，此过程约需10-15分钟。请等待初始化完成，直至主界面就绪。

（3）检查耗材： 确认有足够的一次性 MicroAmp® Optical 96-Well或8-Strip Reaction Plates（反应板）和 Optical Adhesive Covers（光学封膜）。

2、实验设计

（1）创建实验文件： 在软件主界面，选择 “Create New Experiment" 或 “File -> New"。

（2）选择实验类型： 在实验设置向导中，选择 “Quantitation (Standard Curve)"（标准曲线定量）、“Comparative Ct (ΔΔCt)"（相对定量）或其他适合您实验的类型。

（3）设置探针/染料： 在 “Detectors" 或 “Dye Manager" 中，添加您实验中使用的荧光染料（如 FAM, VIC）或探针。为每个检测目标指定名称和报告基团/淬灭基团类型。

（4）设置反应体系： 指定反应体积（通常为20-50 μL）。

3、配制PCR反应体系

（1）在冰上或超净工作台中操作： 确保所有试剂解冻并短暂离心。

（2）配制预混液： 根据实验设计，按比例混合除模板DNA外的所有试剂（如Master Mix、引物、探针、水）。建议配制一定冗余（例如，多配10%的量）以补偿加样误差。

（3）分装： 将预混液分装到PCR反应板或八连管中。

（4）加入模板： 最后加入模板DNA，并轻轻混匀（避免产生气泡）。强烈建议设置复孔（至少3个技术重复）以及阴性对照（No Template Control, NTC）和阳性对照。

（5）封膜： 使用光学封膜密封反应板，确保封膜平整、无褶皱、无气泡。然后用压膜器或滚轮用力压实边缘。

4、上样

（1）清洁样品槽： 用无水乙醇和无尘纸轻轻擦拭7500仪器的样品槽基座，去除任何灰尘或污染物。

（2）放置反应板： 将封好膜的反应板放入样品槽中，确保反应板的左上角（A1孔）对准样品槽的左上角标记。轻轻向下按压四角，确保板子放置平稳。

二、第二阶段：上机运行

1、创建运行方法

（1）设置反应板布局： 在软件界面，点击 “Plate Setup" 选项卡。通过拖放或双击，为每个孔指定其样品名称、任务类型（未知样品、标准品、阴性对照等）和对应的检测探针（Detector）。

（2）编辑运行程序：

点击 “Instrument" 选项卡。

Stage 1 (升温阶段)： 通常为 50°C for 2 minutes（UDG酶防污染孵育，如果试剂包含此成分）。

Stage 2 (预变性)： 通常为 95°C for 10-20 minutes（热启动酶活化）。

Stage 3 (PCR循环)： 设置40-50个循环，包括：

（3）变性： 95°C for 15 seconds。

退火/延伸： 60°C for 1 minute。在此步骤采集荧光信号。软件通常会自动设置为在60°C阶段采集信号。

（可选）溶解曲线阶段： 如果使用SYBR Green染料，需添加溶解曲线步骤。

2、开始运行

（1）保存方法： 保存您的实验文件和运行方法。

（2）启动运行： 点击工具栏上的 “Start Run" 按钮。

（3）确认运行参数： 在弹出的对话框中，再次确认反应板位置、运行方法文件名和样品文件名无误。

（4）开始运行： 点击 “OK"，仪器将开始运行。运行过程中，您可以实时查看扩增曲线和荧光信号的变化。

三、第三阶段：数据分析与关机

1、数据分析

（1）运行结束后，软件会自动保存数据。

（2）设置基线阈值（Threshold）和基线（Baseline）： 这是数据分析的关键步骤。

软件通常会自动设置，但手动调整可能使结果更准确。

阈值（Threshold）： 设置在指数扩增期的线性范围内，通常为荧光信号刚进入指数增长阶段的水平。所有样本的阈值线应保持一致。

基线（Baseline）： 设置为背景荧光信号平稳的循环数范围（通常是前3-15个循环）。

（3）查看结果： 软件会自动给出每个样品的Ct值。您可以在 “Results" 页面查看扩增曲线、标准曲线（如果做了）、熔解曲线（如果做了）以及最终的定量结果。

2、关机

（1）取出反应板： 运行结束后，打开仪器盖子，小心取出反应板。注意：反应板可能很烫，请佩戴防烫手套。

（2）处理废液： 根据您实验室的生物安全规定，将反应板作为生物有害废物妥善处理。

（3）清洁样品槽： 再次用无水乙醇和无尘纸清洁样品槽。

（4）关闭软件： 在电脑上退出7500系统软件。

（5）关闭仪器： 先关闭7500仪器主机电源，然后再关闭电脑。

遵循以上标准操作流程，并结合您具体的实验方案和试剂说明书进行优化，将能确保您获得可靠、准确的实时荧光定量PCR结果。如有任何不确定之处，请务必咨询经验丰富的同事或赛默飞的技术支持。