为什么thermo赛默飞Qubit4.0荧光计检测浓度高？

赛默飞Qubit 4.0荧光计检测出的浓度比预期高（或者比其他方法如Nanodrop高），通常不是仪器本身故障或误差，而是由于其独特且高度特异的工作原理以及样品本身的性质造成的。以下是导致Qubit 4.0检测浓度“偏高"的几个主要原因，按重要性排序：

一、核心原因：检测原理的根本不同 (最关键的一点)

1、Qubit 4.0 - 特异性荧光检测：

Qubit使用一种只有与特定目标分子（如dsDNA、RNA、蛋白质） 结合后才会发出强烈荧光的染料。

染料不会与蛋白质、游离核苷酸、盐离子、溶剂或其他常见污染物结合并发光。

结果：Qubit只报告您想要测量的特定目标分子的浓度。它几乎忽略了所有杂质。

2、其他方法（如Nanodrop） - 紫外吸光度（UV Absorbance）：

Nanodrop基于260nm波长下的吸光度原理。任何在该波长下能吸光的物质都会贡献读数。

这包括：dsDNA, ssDNA, RNA, 游离核苷酸, 蛋白质, 苯酚, 胍盐等常见污染物。

结果：Nanodrop报告的是样品中所有吸光物质的总和，通常会高估纯净目标分子（如dsDNA）的实际浓度。

结论：当您说Qubit浓度“更高"时，很可能是在与Nanodrop对比。在大多数情况下，Qubit的结果更准确，而Nanodrop因为包含了杂质的信号而虚高了。Qubit显示的是“有效浓度"，而Nanodrop显示的是“总吸光物质浓度"。

二、使用了错误的标准曲线或试剂

Qubit的精确度极度依赖于使用正确的、新配制的标准品来生成校准曲线。

1、使用了错误的 assay：例如，您想测的是RNA，但错误地选择了“dsDNA HS"检测程序。不同assay的染料和标准曲线不同，交叉使用会导大的误差。

2、标准品降解或污染：标准品如果反复冻融、保存不当或过期，其浓度会不准，导致绘制的标准曲线斜率错误，从而使所有未知样品的计算结果产生系统偏差（可能偏高也可能偏低）。

3、标准品稀释错误：制备工作液时，必须严格按照说明书操作。如果加入的染料太多或标准品量不准，都会影响结果。

三、样品本身的问题

1、含有干扰荧光读数的物质：虽然Qubit染料特异性很强，但高浓度的某些污染物（如某些去垢剂）可能会影响荧光本身，导致读数异常。

2、样品超出检测范围：每个Qubit assay都有其线性范围（如dsDNA HS assay是0.2-100 ng）。如果您的样品浓度远高于上限，即使仪器自动稀释，也可能因进入非线性区域而导致计算结果不准确。务必确认样品浓度落在所用assay的推荐范围内。

四、总结与建议

当您发现Qubit 4.0浓度偏高时，请遵循以下排查流程：

1、首先确认对比对象：如果是在与Nanodrop对比，通常信任Qubit的结果。它的特异性更强，结果更可靠，尤其对于纯度不高的样品。

2、双重检查实验流程：

我是否选择了正确的检测程序？（dsDNA, RNA, Protein等）

我使用的标准品和染料工作液是否新配制？是否在有效期内？

我是否让反应液孵育了足够长的时间（至少2分钟）？

我是否擦拭了试管？

3、检查样品状态：我的样品浓度是否在** assay的线性范围**内？如果过高，请用缓冲液进行稀释后重新测量。

4、运行诊断：Qubit 4.0仪器本身通常很稳定。如果怀疑仪器问题，可以运行内置的“性能验证"（Performance Verification）测试，使用随机的验证板来确认仪器和探头的功能是否正常。

绝大多数情况下，浓度“偏高"的现象根源在于Qubit更高的特异性凸显了其他方法（如紫外吸光度）的误差。